PROTOZOOLOGY/IMMUNOLOGY
& DIAGNOSIS
PROTOZOOLOGIE, IMMUNOLOGIE ET
DIAGNOSTIC
GUERISON SPONTANEE DES PORCS CAMEROUNAIS
INFECTES EXPERIMENTALEMENT PAR TRYPANOSOMA B. GAMBIENSE. CINETIQUE DES
TRYPANOSOMES CHEZ LES PORCS, SUIVI CLINIQUE, HEMATOLOGIQUE, IMMUNOLOGIQUE,
PARASITOLOGIQUE ET PAR PCR. IMPLICATIONS SUR LA LUTTE CONTRE LA MALADIE DU
SOMMEIL
SPONTANEOUS RECOVERY OF CAMEROONIAN
PIGS EXPERIMENTALLY INFECTED WITH TRYPANOSOMA
BRUCEI GAMBIENSE. KINETICS OF THE TRYPANOSOMES IN THE PIGS. CLINICAL, HAEMATOLOGICAL, IMMUNOLOGICAL, PARASITOLOGICAL AND
PCR-BASED MONITORINGS.
Penchenier I., Alhadji D., Bahébégué S., Simo G.
et Laveissière C.
Summary
The
reappearance of Human African Trypanosomosis (HAT) in Central and Western
Africa, in foci that had given all signs of complete extinction, raises the
question of control of animal reservoir. Screening, treatment of infected
persons, and associated control of the vector have little effect when the
reservoir is allowed to persist. Since the pig is particularly incriminated, we
studied the kinetics of Trypanosoma
brucei gambiense in this species. The experiment involved eight
non-infected pigs, aged 2 months, bred in a village in Cameroon. Six of the
pigs were inoculated with fresh blood containing T. b. gambiense collected from a patient who recently tested
positive. The pigs were placed in an enclosed area protected by mosquito
netting and were monitored for seven months.
Each animal was sampled weekly, for a period of six months, in the
subclavian artery. Immunological tests (card agglutination test for
trypanosomosis - CATT, Latex/T. b.
gambiense), parasitological tests (quantitative buffy coat test - QBC) and
polymerase chain reaction (PCR), as well as the usual blood tests (blood cell
counting and erythrocyte sedimentation rate) were conducted on these samples.
The pigs were also clinically examined and growth rates recorded. The presence of T. b. gambiense in the infected pigs was first noted on the seventh
day. The parasitaemia peaked on the tenth day, then decreased rapidly: the QBC
and PCR reached permanent negative values on Day 108 and Day 115 respectively.
On the other hand, both CATT and Latex/T.
b. gambiense remained positive throughout the experiment. The Latex method
always produced higher seropositivity results than the CATT method. Neither of the control pigs displayed
seroconversion and no trypanosome could be detected, whether by QBC or
PCR. Considering blood tests and
clinical observation, no significant differences were found between infected
and control pigs. Pigs thus seem to
eliminate T. b. gambiense
spontaneously in less than four months.
It appears that the pig reservoir of sleeping sickness would be
suppressed by vector control measures over at least one year, associated with
screening and treatment of the infected patients - provided that no wild animal
reservoir is allowed to reintroduce the parasite in the meantime. The nature of the ‘trypano-resistance’
displayed by the pigs, as well as the extent to which this ability to recover
spontaneously may be affected by interactions with other trypanosomes or by T. b. gambiense re-infestations, appear
as interesting topics for further investigations on the subject.
Résumé
La résurgence de la trypanosomiase humaine africaine en Afrique centrale et de l’ouest dans des foyers que l’on avait pu croire éteints, repose sur le problème de la lutte contre le réservoir animal. Le dépistage et le traitement des malades associés à une lutte antivectorielle sont illusoires si ce réservoir persiste. Le porc étant particulièrement incriminé, nous avons étudié la cinétique de Trypanosoma brucei gambiense chez cet animal. L’expérimentation a porté sur 8 porcs non parasités, âgés de 2 mois provenant d’un village Camerounais. Six d’entre eux ont été inoculés avec du sang frais contenant
T. b. gambiense, provenant d’un malade récemment dépisté. Les porcs placés dans un local clos, sous moustiquaire, ont été suivis pendant 7 mois. Chaque porc était prélevé en
sous-clavière chaque semaine. Des examens immunologiques (CATT, Latex/T.b.gambiense), parasitologiques (QBC) et de la PCR ainsi qu’une surveillance hématologique (NFS, VS) ont été réalisés, pendant 6 mois, sur ces prélèvements. De plus, la croissance des porcs et leur état clinique ont été notés.
La présence de T.b. gambiense a été constatée dès le 7ème jour avec un pic vers le 10ème jour. La parasitémie a rapidement chuté pour devenir définitivement négative chez les porcs inoculés, à J108 au QBC et J115 à la PCR. CATT et Latex T.b.g. sont demeurés positifs durant toute l’expérimentation. La séropositivité au Latex T.b.g. a toujours été supérieure à celle obtenue par le CATT. Les 2 porcs témoins n’ont jamais montré de séroconversion et la présence de trypanosomes n’a pu être mise en évidence ni par le QBC ni par la PCR. Nous n’avons noté aucune différence significative dans le suivi hématologique et dans le suivi clinique entre les porcs inoculés et les porcs témoins.
Il apparaît donc que les porcs éliminent spontanément T. b. gambiense en moins de 4 mois et que la lutte antivectorielle d’au moins un an, associée au dépistage et au traitement des malades, supprimerait le réservoir porcin de la maladie du sommeil. Encore faut-il qu’aucun réservoir sauvage ne vienne réintroduire le parasite.
Il serait intéressant d’étudier la nature de la
« trypanorésistance » des porcs ainsi que l’impact des interactions
avec les autres trypanosomes sur leur aptitude à l’autoguérison ainsi que celui
des réinfestations par T. b. gambiense.
Introduction
L’une des explications de la pérennité de la THA pourrait être l’existence d’un réservoir animal qui maintiendrait la transmission de la maladie à “bas bruit” et qui serait à l’origine de l’échec des différentes campagnes de lutte.
De nombreuses études réalisées en Afrique de l’Ouest ont montré que les animaux domestiques étaient des réservoirs potentiels de trypanosomes pathogènes pour l’homme. De tous les animaux domestiques incriminés, c’est le porc qui paraît être le réservoir animal essentiel. Il était déjà soupçonné comme tel dans les années 30 (Van Hoof et al., 1937). Deux arguments plaident en cette faveur comme l’ont montré des études faites en Côte d’Ivoire : d’une part la mise en place de pièges dans et autour des villages a permis de déterminer que 75 à 90 % des repas des glossines proviennent de cet animal (Mehlitz, 1986; Laveissière et Hervouët, 1991); d’autre part plus de 60 % des porcs sont porteurs de T.brucei sl. dont T.b. gambiense (Mehlitz, 1986; Penchenier et al., 1997).
Le réservoir porcin représente donc un grave danger dont l’assainissement est impératif. La question qui vient immédiatement à l’esprit est de savoir s’il faut le traiter ou le détruire. Or, le traitement de cet important réservoir de THA est difficile et onéreux, incompatible avec les possibilités financières des collectivités locales; sa destruction totale est inacceptable pour des raisons économiques et humaines.
Selon certains auteurs, les porcs porteurs de trypanosomes humains guériraient spontanément (Van Hoof et al., 1942; Schutt & Mehlitz, 1981; Mehlitz, 1986). Ces auteurs qui ont travaillé sur la transmission cyclique du parasite ont constaté respectivement que les trypanosomes pouvaient se maintenir 588j, 154j et plus de 200j dans son hôte mais qu’ils finissaient par disparaître.
L’éventualité de la guérison spontanée devrait être prise en considération, pour éventuellement adapter les stratégies de lutte contre la THA dans les foyers où l’homme et le porc cohabitent. C’est pourquoi nous avons entrepris cette étude afin de voir, avec des techniques diagnostiques plus performantes que celles utilisées par les auteurs précités, combien de temps le porc restait porteur de T.b. gambiense et, par là même, combien de temps il faudrait maintenir une lutte antivectorielle pour que le porc ne soit plus un danger pour l’homme.
Matériel et
méthodes
Préparation des porcs
à l’expérimentation
Nous avons utilisé huit porcs (4 mâles et 4 femelles) domestiques indigènes âgés de 2 mois et achetés à Menji, dans la région de Fontem au sud-ouest du Cameroun. Dans ce village situé à plus de 1.000 mètres d’altitude, il n’y a pas de glossines.
Les porcs ont été immédiatement transportés à Yaoundé dans un véhicule fermé et placés dans une porcherie préparée à leur intention.
La porcherie est un bâtiment fermé entièrement protégé de l’intrusion de glossines par la mise sous moustiquaire des boxes et par la protection des alentours du bâtiment par des pièges vavoua imprégnés de deltaméthrine.
Un bilan complet par CATT 1.3, LATEX/T.b.gambiense, QBC, PCR, NFS, VS et mensurations a été fait à l’arrivée des porcs. Ils ont alors été mis en observation pendant 6 semaines. Une dizaine de jours avant leur inoculation, nous les avons immunodéprimés avec de la cyclophosphamide (Endoxan-Asta®) à raison d’un comprimé (50 mg) par porc tous les trois jours.
Tout au long de l’expérience, les porcs ont été exclusivement nourris avec de la provende industrielle achetée chez un fabricant de Yaoundé et abreuvés de l’eau de la ville de Yaoundé.
Inoculation et
protocole de suivi
Trois jours après la dernière prise d’Endoxan®, trois porcs femelles et trois porcs mâles tirés au sort ont été inoculés, par injection sous-clavière et intra-péritonéale, avec une souche de T.b. gambiense provenant du sang frais d’un malade non encore traité de la région de Campo. Un porc femelle et un porc mâle n’ont pas été inoculés : ils ont été utilisés comme témoins.
Le suivi des porcs a duré six mois. Il a porté sur l’évolution de l’infection (suivi immunologique et parasitologique) et sur les répercutions sur l’état général de l’animal (état clinique, mensurations, éléments figurés du sang).
Etat Général
A chaque visite, nous avons estimé l’état clinique des porcs : état général, vivacité, comportement… et toutes les deux semaines nous les avons mesurés (périmètre thoracique, périmètre du cou, périmètre de la cuisse, hauteur au garrot et longueur). N’ayant pas de balance appropriée, nous avons déterminé un indice relatif au volume et, partant, proportionnel au poids. Nous avons utilisé la formule suivante: V(cm3) = périmètre thoracique x longueur x hauteur au garrot.
Cet indice n’a aucune signification réelle, mais il donne une idée de la croissance.
Enfin, nous avons recherché, toutes les 2 semaines, en même temps que les mensurations, d’éventuelles répercutions hématologiques (anémie, infections intercurrentes…) par une NFS et une VS réalisées au Centre Pasteur de Yaoundé sur COULTER Max M.
Immunologie et parasitologie
Le suivi immunologique s’est fait par le CATT 1.3 sur sang total et sur sang dilué et par le Latex T.b. gambiense sur sang dilué. La recherche de trypanosomes dans le sang a été faite immédiatement après le prélèvement par QBC. Pour la PCR, l’extraction de l’ADN a été faite selon le protocole décrit par Penchenier et al. (1996 modifié 2000). Les amorces spécifiques (TBR1 et TBR2 ) de Trypanosoma brucei SSP utilisées sont celles de Moser et al (1989).
Pour les tests immunologiques et le QBC, les prélèvements de sang ont eu lieu deux fois par semaine pendant les quatre premiers mois et une fois par semaine les deux derniers mois. La PCR a été effectuée toutes les 2 semaines durant les 4 premiers mois et une fois par semaine les 2 derniers mois. Le sang de chaque porc, prélevé en sous-clavière, est rapidement transféré dans un tube contenant de l’EDTA qui servira à l’ensemble des tests.
Analyse
statistique des données
Les
données ont été analysées grâce au logiciel “Statistic”
Pour comparer l’évolution de la parasitémie chez les porcs, nous avons utilisé le test F de Fisher Snedecor.
Résultats
Parasitémie des porcs
QBC
Le
nombre de trypanosomes mis en évidence par le QBC (données en nombre de
trypanosomes/60µl) chez les porcs est reporté dans la figure 1.
Figure 1 : Evolution de la parasitémie chez les porcs inoculés
nf = non fait.
PF1 : porc femelle no 1 PM1 : porc mâle no 1
PF2 : porc femelle no 2 PM2 : porc mâle no 2
PF 3 : porc femelle no 3 PM3 : porc mâle no 3
PFT : porc femelle témoin PMT : porc mâle témoin
- les trypanosomes sont décelés dans le sang de tous les porcs 7 jours après leur inoculation et la parasitémie, élevée les premiers jours, baisse progressivement puis se négative définitivement entre 59 et 108 jours;
-
la
parasitémie chez les 2 porcs témoins est demeurée négative tout au long de
l’étude. Les valeurs de K pour les
femelles et pour les mâles sont respectivement égales à 2,64 et 1,52. La différence entre les moyennes n’est pas
significative (ddl = 2 P = 0,05).
Résultats de la
PCR
La
PCR effectuée 10 jours après l’inoculation est positive chez tous les porcs
inoculés. Elle reste positive chez
toutes les femelles jusqu’au 97ème jour et jusqu’au 83ème chez les mâles. Un des mâles reste positif jusqu’au 115ème
jour.
Les témoins sont demeurés négatifs à la PCR tout au long de l’étude.
Résultats
immunologiques
Les anticorps ont été décelés dans le sang des porcs infectés 14 jours après leur inoculation.
Il y a globalement une différence entre les 2 tests immunologiques : le CATT latex donne des résultats positifs à des dilutions plus élevées que le CATT 1.3.
Le taux des anticorps demeure élevé pendant toute la phase parasitémique puis diminue progressivement sans pourtant s’annuler. On peut noter, grossièrement, deux vagues immunologiques. La première correspond au pic parasitologique du début de l’infection et s’atténue chez les mâles comme chez les femelles vers le 35ème jour, et la seconde a lieu chez les femelles entre le 56ème et le 73ème jour alors que chez les mâles elle a lieu plus tardivement, entre le 80 et le 94ème jour.
Les tests immunologiques chez les porcs témoins sont demeurés négatifs.
PM : moyenne des 3 porcs mâles inoculés
PFT : porc femelle témoin
PMT : porc mâle témoin
On observe des courbes d’allure relativement semblable qui évoluent positivement.
Chez les mâles comme chez les femelles, la valeur de F est inférieure à la valeur de la table de Snedecor pour un risque de 0,05. La différence entre les moyennes n’est donc pas significative. Ceci suggère que la croissance n’est pas altérée par l’infection à T.b. gambiense.
Résultats
hématologiques
Le
matériel utilisé étant calibré pour les éléments figurés du sang humain, nous
ne donnerons pas ici de résultats détaillés.
Tous les résultats obtenus montrent qu’il n’y a pas de variation notable de la NFS et de la VS durant l’expérimentation et qu’il n’y a pas de différence entre porcs inoculés et porcs témoins.
Discussion
Depuis 1937, (Van Hoof et. al.) de nombreux auteurs dont Kageruka (1977), Mehlitz (1977; 1986), Noireau (1986), Penchenier (1997; 1999), ont montré qu’en Afrique de l’ouest et en Afrique centrale le porc indigène peut être un réservoir de T.b. gambiense et que celui-ci développe une affection asymptomatique évoluant vers la guérison spontanée. Mais dans la nature, reste-t-il longtemps un réservoir de virus au point d’entretenir l’endémicité trypanosomique ? Autrement dit, si la guérison spontanée existe, au bout de combien de temps survient-elle ?
Van Hoof et. al. (1940) ont observé chez des porcs expérimentalement inoculés cycliquement avec une souche de T.b. gambiense dont le sang a été examiné en goutte épaisse que la guérison survient en moyenne (16 porcs suivis) 292 jours après le début de l’infection avec un minimum de 100 jours et un maximum de 588 jours. Ces auteurs ont observé que, par passages cycliques répétés, l’infectiosité de T. brucei gambiense ne se perdait qu’au bout de 4 ans. Schutt et Mehlitz (1981) ont constaté, en utilisant la mini colonne échangeuse d’anions (Maect), une persistence de la parasitémie d’au moins 154 jours dans un porc mécaniquement infecté à partir d’un isolement primaire de T.b. gambiense. Mehlitz et al. (1986) reprenant cette étude sur le porc à partir de formes sanguicoles et métacycliques de T. b. gambiense constatent par Maec que le parasite persiste 200 jours chez son hôte expérimental. Dans notre étude, nous avons utilisé des formes sanguicoles de T.b. gambiense transmises mécaniquement. En utilisant le QBC les trypanosomes ont disparu du sang des porcs en 59 à 108 jours alors que par PCR la disparition a eu lieu entre 83 et 115 jours.
Les conditions de détention des porcs qui, dans les 3 cas, ont été maintenus protégés de toute réinfection et bien nourris, ne peuvent être à l’origine des différences constatées entre nos travaux et ceux de Van Hoof ou de Mehlitz.
Il est également peu probable que les techniques que nous avons utilisées puissent expliquer ces différences car si le QBC a une sensibilité (seuil de détection : 450 T/ml) moindre que celle de la Maec (seuil de detection : 100 T/ml), la PCR est indiscutablement la plus performante des techniques (seuil de détection : 1 T/ml). Cependant, il ne faut pas perdre de vue que la technique de la PCR détecte l’ADN du parasite et non le parasite lui-même. Cela dit, les travaux menés chez l’homme par Penchenier et al. (2000) ont montré que la PCR est la meilleure technique de diagnostic parasitologique.
Reste la souche de trypanosome utilisée, sa conservation, le mode de transmission utilisé et les porcs eux-mêmes. Dans les travaux de Van Hoof et al. (1940), la souche de trypanosome provient d’un malade de Léopoldville. Elle a été passée mécaniquement sur cobaye puis cycliquement aux porcs. Les 16 porcs ayant donné lieu à des résultats publiés sont originaires de Léopoldville sans que leur race soit précisée. Il peut donc s’agir de porcs d’origine européenne. Dans les travaux de Mehlitz et al. (1986), sept Porcs ont été inoculés. Dans tous les cas il s’agit de porcs domestiques indigènes du Liberia.
Deux d’entre eux ont été infectés cycliquement à partir d’un stock de trypanosomes isolés d’un malade du Libéria puis passé sur singe (Cercocebus torquatus) et sur rat de Gambie (Cricetomys emini). Cinq autres porcs ont été innoculés mécaniquement. Pour 2 de ces porcs l’inoculation a été faite à partir du stock décrit ci-dessus. Deux autres ont été inoculés à partir d’un stock de T. brucei (type gambiense) isolé d’un porc ivoirien et ayant subi 5 passages sur rongeurs (Mastomyces natalensis). Le dernier des 5 porcs est le seul à avoir été inoculé directement à partir d’un malade (du Libéria). Seul ce dernier porc correspond à notre méthodologie. La présence de trypanosomes a été constatée pendant 150 jours. On peut donc légitimement se demander si le mode de transmission ne peut pas expliquer les différences constatées et si le fait de passages répétés sur d’autres mammifères n’influe pas sur les parasites inoculés aux porcs.
Dans notre étude, aucun porc n’a de parasite détectable au 3ème jour mais tous sont parasités au 7ème jour avec un pic vers le 10ème jour. Le nombre maximal de trypanosomes varie de 17 à 250 T/60µl, soit de 3.102 à 4.103 T/ml (moyenne d’environ 103 T/ml). La parasitémie des porcs de l’étude de Mehlitz et al. ne dépasse pas 5.103 T/ml. Elle est de 5.102 dans le cas du porc comparable aux nôtres avec une période pré-patente de 30 jours. L’administration d’endoxan peut expliquer que, dans notre étude, la pré-patence ne soit que de 7 jours. D’autres auteurs ont observé des pré-patences de 2 à 7 jours (Agu et Bajeh, 1986; Ilemobade et Balagun, 1981; Mumah, 1998). Il est à noter que la période pré-patente dépend de nombreux paramètres, entre autres le nombre et l’espèce des parasites inoculés, la voie d’administration, le statut génétique de l’animal inoculé, son état immunitaire préalable, son alimentation (Genetet, 1993).
Durant le suivi parasitologique, on constate l’existence de
phases aparasitémiques plus ou moins longues alternant avec des parasitémies
qui dépassent rarement 103 T/ml de sang. Ces fluctuations de la prasitémie avaient déjà été décrites par
Cross (1975), Mehlitz (1986) et Mumah (1998) et pourraient être la conséquence
de la variation antigénique du trypanosome alors que le faible taux des
parasitémies pourrait être dû à la capacité naturelle des porcs de contrôler le
développement de T.b. gambiense.
L’étude de l’évolution de la croissance chez les porcs montre qu’il n’y a pas eu de différence significative entre les porcs infectés avec T.b. gambiense et les porcs témoins. Tout au long de l’expérimentation, la santé des porcs est restée inaltérée (clinique et hématologique) et leur croissance a été régulière, semblable à celle des porcs témoins. Ceci confirme les constatations de Van Hoof (1940) et Mehlitz (1986) qui considèrent les porcs comme des porteurs asymptomatiques de parasites de la maladie du sommeil.
Les porcs sont donc trypanotolérants, c’est-à-dire qu’ils ont la capacité de contrôler le développement des trypanosomes, de limiter leurs effets pathologiques et finalement d’éliminer les trypanosomes de leur organisme. Toutefois, les mécanismes développés par ces animaux ne sont pas encore élucidés. Mattioli et Wilson (1996) pensent que la présence de facteurs trypanocides dans le sérum de certains animaux leur confère une résistance à l’infection trypanosomienne. Les anticorps joueraient également un rôle fondamental dans la résistance aux trypanosomes dans la mesure où les titres d’anticorps varient dans le même sens que la parasitémie. Néanmoins, Mumah (1998), après avoir inoculé des porcs avec un isolat de T.b. brucei d’origine bovine, a observé, entre autres symptômes, une anémie, une anorexie, un poil rêche, des suppurations oculaires mucopurulentes, une émaciation, une hyperémie de la peau et une perte de coordination.
Omeke et Igboeli (2000) ont, quant à eux, noté chez des porcs expérimentalement infectés avec T.b. brucei que ceux-ci présentent des troubles de la spermatogenèse dus à la déformation des tubes séminifères et la dégénérescence des cellules germinales et de Sertoli. Ces résultats suggèrent que les porcs réagissent différemment en présence de T.b. brucei ou de T.b. gambiense.
Les résultats immunologiques confirment que le CATT 1.3 et le LATEX/T.b. gambiense sont utilisables chez le porc porteur de T.b. gambiense. Les anticorps sont retrouvés dans le sang à partir du 14ème jour après l’inoculation et 7 jours après que la parasitémie ait été mise en évidence et persistent après la disparition des parasites. On constate que le LATEX/T.b. gambiense donne des résultats positifs à des dilutions plus élevées que le CATT 1.3. Rappelons que le LATEX/T.b. gambiense est constitué d’une suspension lyophilisée de particules de latex couverte d’antigènes de surface variables de T.b. gambiense de types antigéniques LiTat 1.3, 1.5 et 1.6 alors que le CATT 1.3 est constitué de trypomastigotes sanguicoles lyophilisées de Trypanosoma brucei gambiense (T.b. gambiense) de type antigénique LiTat 1.3.
Conclusion
En Afrique centrale et de l’ouest, T.b. gambiense provoque chez le porc une affection asymptomatique qui évolue vers la guérison spontanée. Le porc est trypanotolérant pour ne pas dire trypanorésistant. Malgré cela, il demeure pendant longtemps un réservoir de virus et peut, de ce fait, entretenir l’endémicité de la trypanosomose humaine africaine. L’assainissement du réservoir porcin doit donc nécessairement être intégré dans les programmes de lutte contre la THA. Pour des raisons économiques et humaines, il n’est envisageable ni de traiter tous les porcs ni de les éliminer.
Compte tenu du fait que les porcs guérissent spontanément, nous proposons de les laisser en l’état et de mettre en place conjointement, dans les foyers de la THA, un dépistage de la maladie et le traitement des malades avec une lutte antivectorielle suffisamment prolongée pour que les porcs aient le temps d’éliminer leurs trypanosomes.
Au vu de nos résultats, qui montrent que les porcs ne sont plus porteurs de trypanosomes au bout de 83 à 115 jours, nous estimons qu’un an de lutte antivectorielle est suffisant pour rompre la chaîne de transmission porc-glossine-porc et donc porc-glossine-homme.
Cependant, après la lutte antivectorielle, il restera toujours la menace d’un cycle intermédiaire entre le cycle “sauvage” (assuré par la pénétration de l’homme dans le biotope des animaux sauvages) et le cycle “domestique” qui réintroduit le parasite dans la communauté porcine. C’est pourquoi la lutte contre la maladie du sommeil doit combiner une surveillance médicale intensive et pérenne de la population exposée à un renforcement des opérations visant à réduire les populations vectrices.
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A COMPARATIVE STUDY ON CLINICAL, PARASITOLOGICAL AND MOLECULAR
DIAGNOSIS OF BOVINE TRYPANOSOMOSIS IN UGANDA
UNE ETUDE COMPARATIVE DU DIAGNOSTIC CLINIQUE, PARASITOLOGIQUE ET
MOLECULAIRE DE LA
TRYPANOSOMOSE BOVINE EN OUGANDA
Magona
J. W1,3, Fèvre EM2, Coleman PG2 , Jonsson, N, N1 , Welburn SC2 , Eisler, M. C1
1University of
Glasgow Veterinary School, Bearsden Road, Bearsden G61, 1QH, Glasgow, UK
2Centre for
Tropical Veterinary Medicine, The University of Edinburgh, Easter Bush, Roslin,
Midlothian, Scotland EH25 9RG, UK
3 Livestock
Health Research Institute, P.O. Box 96, Tororo, Uganda
Résumé
(a) Le diagnostic clinique basé sur le dépistage de : l'anémie, la fièvre, l'hypertrophie des ganglions lymphatiques superficiels, l'atrophie, l'hémorragie pétéchiale, la pâleur des membranes muqueuses, l'écoulement oculaire et la diarrhée; (b) le diagnostic parasitologique avec des frottis et des gouttes épaissses, HCT et la technique "buffy coat" et (c) le diagnostic par PCR utilisant des amorces de Trypanosoma brucei, T. vivax, T. congolense type forêt, Kilifi, savane, ont été comparés pour diagnostiquer la trypanosomose bovine chez 250 zébus exposés à l'infection trypanosomienne naturelle dans l'est de l' Ouganda. Sur ces 250 zébus, le diagnostic clinique a détecté 184 (73,6%), la PCR 99 (39,6%) et le diagnostic parasitologique 36 (14,4%). 28 (77,7%) des animaux dépistés parasitologiquement positifs et 84 (84,8%) bovins testés positifs par PCR ont montré des signes cliniques. Sur les animaux parasitologiquement positifs, 33 ; 3, 13 et 12 avaient T. brucei, T. congolense, T. vivax et une infection mixte, respectivement. Parmi ceux-là 78,7% ; 33% ; 84% et 83% , respectivement, ont montré des signes cliniques. Parmi les animaux testés positifs par PCR 89 ; 12 ; 3 ; 6 ; 27 et 24 avaient T. brucei, T. vivax, T. congolense sous-type forêt, T. congolense sous-type savane, T. congolense sous-type Tsavo et une infection mixte respectivement. Parmi ces animaux 83% ; 92% ; 100% ; 66,7% ; 81% et 75% ont montré des signes cliniques, respectivement. Cette étude a révélé que la PCR est 3 fois plus sensible que la technique parasitologique et a détecté un nombre important d'animaux atteints de trypanosomose. Généralement, le traitement du bétail basé sur le diagnostic parasitologique tient rarement compte des manifestations cliniques des animaux en question. Toutefois, cette étude a montré qu’un nombre important d'animaux parasitologiquement positifs a aussi présenté des signes cliniques. En conclusion, le traitement bovin basé sur les symptômes pourrait cibler jusqu’à 85% ou 78% des animaux qui auraient pu être détectés par PCR ou parasitologiquement, respectivement. L'examen clinique pourrait être utilisé pour un dépistage initial des animaux malades avant l'application de tests de diagnostic pour confirmer.
Summary
Clinical diagnosis based on detection of anaemia, fever, staring coat, enlarged superficial lymph nodes, wasting, petechial haemorrhages, pallor of mucous membranes, ocular discharge and diarrhoea, parasitological diagnosis using thick and thin blood smears, HCT and Buffy coat technique and Polymerase chain reaction using primers for detection of Trypanosoma brucei, T. vivax, T. congolense (Forest, Kilifi, Savanna and Tsavo) were compared for diagnosis of bovine trypanosomosis in 250 zebu cattle exposed to natural trypanosome challenge in Eastern Uganda. Of the 250 cattle, clinical diagnosis detected 184 (73.6%), PCR detected 99 (39.6%) and parasitological diagnosis detected 36 (14.4%) of the animals as diseased. Twenty-eight (78%) of the parasitologically positive and 84 (87.5%) of PCR positive cattle manifested clinical signs. Of the parasitological positive, 33, 3, 13 and 12 had T. brucei, T.congolense, T. vivax and mixed infection, respectively. Of these, 78%, 33%, 84% and 100% had clinical signs, respectively. Of the PCR positives, 89, 12, 3, 6, 27 and 24 had T. brucei, T. vivax, T.congolense forest subtype, T. congolense savanna subtype, T. congolense Tsavo subtype and mixed infections, respectively. Of these, 83%, 91%, 100%, 67%, 81% and 100% had clinical signs, respectively. This study has revealed that a substantial number of parasitological and PCR positive animals also manifest clinical signs. In conclusion, treatment of cattle based on clinical signs may clear up to 87.5% or 78% of the animals that would be PCR positive or parasitologically positive, respectively. Clinical examination could be used in the initial screening of cattle for trypanosomosis before confirmatory diagnostic tests are applied.
Introduction
Diagnosis
of trypanosomosis relies on parasitological diagnosis using thin and thick blood
smears, haematocrit centrifuge technique (Woo, 1969), phase contrast buffy-coat
technique (Murray et al., 1977) and
serological diagnosis using the antigen-detection enzyme linked immunosorbent
assay (ELISA) (Nantulya and Lindqvist, 1989), the antibody ELISA (Luckin, 1977;
Hopkin et al., 1998; Rebeski et al., 1999). More recently polymerase
chain reaction (PCR)-based techniques have been used in detecting trypanosomes
in bovine blood (Solano et al.,
1998).
Direct
parasitological techniques such as phase-contrast buffy-coat technique and
thick and thin films have poor to fair diagnostic sensitivity under field
conditions. Unlike the thick and thin films, recent findings have revealed that
the phase-contrast buffy-coat technique has good diagnostic sensitivity (67-96%
for Trypanosoma congolense infection
and 60-76% for T. vivax infection)
under optimised conditions (Eisler et al.,
1998). Despite their low sensitivity,
direct parasitological tests are suitable for field application and for
diagnosis of individual cases.
Serological tests for trypanosomosis may only be useful in providing
information for targeting tsetse and trypanosomosis control (Hopkins et al.,
1998) and for epidemiological studies. Unlike the antibody-detection ELISA, the
antigen-detection ELISAs for trypanosomosis have been shown to lack specificity
and also sensitivity (Desquesness, 1996; Eisler et al., 1998). PCR-based techniques are highly sensitive and
specific experimental tests for detecting trypanosomal DNA in either the vector
or the host. PCR has been shown to be useful for the detection of trypanosome
infections in cattle with haematocrit values below 25% (Solano et al., 1998). Nevertheless, PCR has
been scarcely used to assess the prevalence of trypanosomosis on field samples,
due to its time-consuming and prohibitive cost aspects, and requirement for
technical expertise (Solano et al.,
1999). Furthermore, PCR requires specialised equipment and is not suitable for
use as a basis for treatment of individual animals, especially in remote rural
areas. Despite the availability of the above parasitological, serological and
molecular diagnosis tests for animal trypanosomosis, there are no simple
pen-side diagnostic tests for on-spot diagnosis of individiual cases of animal
trypanosomosis by veterinarians. Under such circumstances field veterinarians
have to rely on clinical diagnosis to treat cases. The common signs of animal
trypanosomosis looked for include anaemia, fever, staring coat, enlarged
superficial lymph nodes, wasting, petechial haemorrhages, pallor of mucous
membranes, ocular discharge and diarrhoea. The sensitivity of clinical
diagnosis based on these signs is not known. In this study clinical diagnosis
was compared to parasitological and molecular diagnosis to evaluate its
sensitivity.
Materials and Methods
This work was conducted in Tororo and Soroti districts of Uganda. A total of 250 village cattle were examined clinically by general physical examination and were bled from the jugular vein using vacutainer (Dickinson and Becton). Blood was examined in the field using both the haematocrit centrifugation technique (Woo, 1969) and the buffy coat technique (Murray et al., 1977). Some blood in a vacutainer with non-coagulant was centrifuged and buffy coats were decanted and kept under liquid nitrogen. Buffy coats were examined using PCR with primers for T. brucei, T. vivax, T. congolense forest subtype, T. congolense savanna subtype and T. congolense Tsavo subspecies. Packed cell volume was measured using PCV reader (Hawksley, England).
Results
Of the 250 cattle, clinical diagnosis detected 184 (73.6%), PCR detected 99 (39.6%) and parasitological diagnosis detected 36 (14.4%) of the animals as diseased. Tables 1a and b show the sensitivity and specificity of clinical diagnosis as assessed based on parasitological diagnosis and PCR. Using parasitological diagnosis as a gold standard, clinical diagnosis had fair sensitivity (78%), but a low specificity (27%). When clinical diagnosis was evaluated based on PCR as the gold standard, it had a high sensitivity (87.5%), but a poor specificity (25%). Table 2 shows the detection rate of clinical diagnosis of trypanosome infections caused by different trypanosome species as confirmed by parasitological diagnosis. Clinical diagnosis had the highest detection rate (100%) for mixed infections due to T. brucei with T. congolense and T. brucei with T. vivax followed by T. vivax infections (84%), T. brucei infections (78%) and T. congolense (33%). Table 3 shows the detection rate of clinical diagnosis of trypanosome infections caused by various trypanosome species as confirmed by PCR. Clinical diagnosis had the highest detection rate (100%) for trypanosome infections due to T. congolense forest subspecies and mixed infections of T. congolense Tsavo subspecies with T. vivax, T. brucei with T. congolense forest and Tsavo subspecies