PROTOZOOLOGY AND IMMUNOLOGY
PROTOZOOLOGIE ET IMMUNOLOGIE
RELATIONSHIP BETWEEN TRYPANOSOMA
EQUIPERDUM, T. EVANSI AND T. B. BRUCEI AS REVEALED BY
MOLECULAR FINGERPRINTING
CARACTERISATION DE TRYPANOSOMA
EQUIPERDUM, T. EVANSI ET
T. B. BRUCEI PAR EMPREINTE MOLECULAIRE
Claes F.1,2, Agbo
E.3, Baltz T.4, Goddeeris B. M.2 and Büscher
P.1
1 Institute of Tropical Medicine Prince Leopold,
Department of Parasitology.
Nationalestraat 155. B-2000
2 Faculty of Agriculture and
Applied Biological Science, K.U.Leuven. Laboratory
for
Physiology and Immunology of Domestic Animals,
Kasteelpark
Arenberg 30, 3000
3 Institute for Animal
Science & Health (ID-Lelystad),
Division of Animal Sciences,
Lelystad, The
4 Laboratoire de Parasitologie Moleculaire,
Université
Victor Segalen Bordeaux II, Bordeaux, France
Résumé
Trypanosoma equiperdum est responsable de la dourine
chez les chevaux alors que T. evansi et T. b. brucei sont à
l’origine respectivement du surra et du nagana chez une large gamme d’hôtes.
Chez les chevaux, les signes cliniques de la dourine, du surra et du nagana
chroniques sont très similaires, ce qui empêche tout diagnostic différentiel
avec certitude. Avant le début de cette étude, aucun test parasitologique ou
sérologique ne permettait de faire la distinction entre ces trois parasites.
Les tests moléculaires spécifiques à l’espèce pour tout le sous-genre Trypanozoon
ne sont pas encore disponibles et les techniques moléculaires existantes de
détection de trypanosomes n’ont pas été validées à des fins diagnostiques. Dans
cette étude, nous avons examiné différents isolats de T. equiperdum, T.
evansi et T. b. brucei en utilisant comme technique la PCR du
gène RoTat 1,2 et une approche RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) et MEGA
(multiplex-endonuclease genotyping approach). Les résultats montrent que la
plupart des souches de T. equiperdum sont très similaires ou même
identiques à T. evansi. Seuls deux isolats de T. equiperdum, BoTat
1 et OVI diffèrent de T. evansi mais ne peuvent pas être différenciés de
T. brucei. En l’absence d’information sur l’origine de la plupart des
souches de T. equiperdum étudiées et en l’absence d’isolat récent, ces
résultats préliminaires suggèrent que T. equiperdum pourrait constituer
une sous-espèce de T. brucei.
Summary
Trypanosoma equiperdum causes the disease dourine in horses while T.
evansi and T. b. brucei cause Surra and Nagana in a broad range of
hosts. In horses, clinical signs of
dourine, chronic Surra and chronic Nagana are very similar and prohibit correct
differential diagnosis. Before the start of this study, neither parasitological
nor serological test could make a distinction between these three
parasites. Species-specific molecular
tests for all Trypanozoon taxa are not available and the existing
molecular trypanosome detection techniques have not been validated for
diagnostic purposes. In this study, we examined different stocks of T. equiperdum,
T. evansi and T. b. brucei using P.C.R RoTat 1.2, Random
Amplified Polymorphic D.N.A (R.A.P.D) and Multiplex-Endonuclease
Genotyping Approach (M.E.G.A). The results
show that most T. equiperdum reported strains are very similar if not
identical to T. evansi. Only two T. equiperdum reported strains,
in casu BoTat 1 and OVI differ from T. evansi but could not be
distinguished from T. brucei.
From these data, together with the lack of original information on some
of the analyzed T. equiperdum stocks, it appears that true T.
equiperdum is a subspecies of T. brucei.
Introduction
Trypanosoma
equiperdum is a protozoan parasite
that causes the disease dourine in horses. There is no cure for this disease
and infected animals have to be slaughtered (Stephen, 1986). Another trypanosome, Trypanosoma evansi, of
the same subgenus Trypanozoon, causes the disease surra in horses. Surra
can be treated in different ways. T. evansi is closely related and
morphologically identical to T. equiperdum. Both parasites can be found
in Equidae in South and Central America, North and Southern Africa, and
Materials and
methods
Trypanosome
populations
A collection of
four T. b. brucei, eight T. evansi and ten T. equiperdum
populations, derived from strains isolated all over the world, was used in this
study (Table 1). All populations were kept as cryo-stabilates in liquid
nitrogen.
Preparation
of trypanosome DNA
Bloodstream form
trypanosomes were expanded in mice and rats and were purified from the blood by
DEAE chromatography (Lanham & Godfrey, 1970), followed by repeated
centrifugation (3 times 20 min., 2000g) and sediment washes with Phosphate
Buffered Saline Glucose (PSG) (38mM Na2HPO4.2H20, 2mM
NaHPO4, 80mM glucose). Finally, trypanosome pellets were
subsequently stored at -80°C.
Twenty
µl of trypanosome pellets (approximately 2 x 107 cells) were
resuspended in 200 µl of Phosphate Buffered Saline (PBS) and the trypanosome
DNA was extracted using the QIAamp DNA mini kit (Westburg, Leusden, The
Netherlands).
PCR RoTat 1.2
Primers were
derived from the RoTat 1.2 VSG sequence (AF317914). Primer sequences (in 5'-3'
direction) were as follows: RoTat 1.2 Forward GCG GGG TGT TTA AAG CAA TA, Tann.
59°C and RoTat 1.2 Reverse ATT AGT GCT GCG TGT GTT CG, Tann. 59°C. Twenty µl of extracted DNA were mixed with 30 ml of a
PCR-mix containing: 1 U Taq DNA recombinant polymerase (Promega, UK), PCR
buffer (Promega, UK), 2.5 mM MgCl2 (Promega, UK), 200 mM of each of
the four dNTPs (Roche, Mannheim, Germany) and 0.8 mM of each
primer (Gibco BRL, UK). Cycling conditions were as follows: denaturation for 4
min. at 94ºC, followed by 40 amplification cycles of 1 min. denaturation at
94ºC, 1 min. primer-template annealing at 59ºC and 1 min. polymerization at
72ºC. A final elongation step was carried out for 5 min. at 72°C.
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Ten µl
of extracted DNA (50 ng/µl) were mixed with 40 ml of a PCR-mix containing: 0.5 U Taq DNA
recombinant polymerase (Promega, UK), PCR buffer (Promega, UK), 3.0 mM MgCl2
(Promega, UK), 200 mM of each of the four dNTPs (Roche,
Mannheim, Germany) and 0.5 mM of the oligonucleotide 10-mer (Gibco
BRL, UK). The different oligonucleotides used were (in 5'-3' direction): RAPD
606 CGG TCG GCC A
(Ventura et al., 2001) and
RAPD ILO 525 CGG
ACG TCG C (Waitumbi & Murphy, 1993). Cycling conditions were as follows: denaturation for 4 min. at
94ºC, followed by 40 cycles of 2 min. denaturation at 94ºC, 2 min.
primer-template annealing at 40ºC and 2 min. polymerization at 72ºC. A final
elongation step was carried out for 5 min. at 72°C.
Multiplex-endonuclease fingerprinting method
(MEGA)
A fine-scale genotyping approach involving multiplex endonucleases in
combination with a pair of cognate adapters was used according to Agbo et al. (2003).
Cluster analysis
The GelCompar II
program was used for cluster analysis of RAPD and MEGA profiles by Unweighted
Pair Group Method with Arithmatic Mean (UPGMA) based on the Dice coefficient.
Results
PCR T. evansi RoTat 1.2 VSG
The PCR amplification yielded a 205 bp product
detected in all tested T. evansi stocks and in eight out of ten
T. equiperdum stocks (Table 1). Only the OVI strain from
Table 1: Trypanosome populations used in this study and their results in PCR
RoTat 1.2
|
Species |
Clone/strain |
Origin |
Year
of isolation |
Host |
PCR
RoTat 1.2 |
|
T. b. brucei |
AnTat 2.2 |
|
1970 |
Tsetse
fly |
- |
|
T. b. brucei |
AnTat 5.2 |
|
1975 |
Cattle |
- |
|
T. b. brucei |
AnTat 17.1 |
R. D. Congo |
1978 |
Sheep |
- |
|
T. b. brucei |
KETRI 2494 |
|
1980 |
Tsetse fly |
- |
|
T. evansi |
AnTat 3.1 |
|
1969 |
Capybara |
+ |
|
T. evansi |
RoTat 1.2 |
|
1982 |
Water
buffalo |
+ |
|
T. evansi |
Merzouga 56 |
|
1998 |
Camel |
+ |
|
T. evansi |
Zagora I.17 |
Morroco |
1997 |
Camel |
+ |
|
T. evansi |
KETRI 2480 |
Kenia |
1979-1981 |
Camel |
+ |
|
T. evansi |
CAN 86 K |
|
1986 |
Dog |
+ |
|
T. evansi |
Stock |
|
1973 |
Horse |
+ |
|
T. evansi |
Stock |
|
1998 |
Water buffalo |
+ |
|
T. equiperdum |
AnTat 4.1 |
unkno wn |
unknown |
unknown |
+ |
|
T. equiperdum |
Alfort |
unknown |
unknown |
unknown |
+ |
|
T. equiperdum |
SVP |
unknown |
unknown |
unknown |
+ |
|
T. equiperdum |
ATCC 30019 |
|
1903 ? |
Horse |
+ |
|
T. equiperdum |
ATCC 30023 |
|
1903 ? |
Horse |
+ |
|
T. equiperdum |
STIB 818 |
P. R.
China |
1979 |
Horse |
+ |
|
T. equiperdum |
American |
unknown |
unknown |
unknown |
+ |
|
T. equiperdum |
Canadian |
unknown |
unknown |
unknown |
+ |
|
T. equiperdum |
OVI |
|
1975 |
Horse |
- |
|
T. equiperdum |
BoTat 1.1 |
|
1924 |
Horse |
- |
Molecular characterization of T. equiperdum using RAPD and MEGA
All data obtained
from both Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and multiplex-endonuclease genotyping approach (MEGA) were combined in one
joint cluster analysis, resulting in one general homology tree (Figure
1). It appears that all T. evansi
cluster out in a homogeneous group. The T. b. brucei tested cluster out
in a heterogenous group. For T. equiperdum the situation is more
complex: eight out of ten T. equiperdum clustered together with the T.
evansi group, while two T. equiperdum strains were more related to T.
b. brucei. A 90 to 96 % similarity coefficient is found for the T.
evansi/T. equiperdum cluster, whereas the T. b. brucei group has a
similarity coefficient of 78 to 83%. The homogeneous T. evansi/T. equiperdum
cluster differed from this T. b. brucei group with a 95% confidence
interval as determined by bootstrap analysis on the homology tree. From this
comprehensive tree, it appears that T. equiperdum BoTat 1.1 shares most
similarity to T. b. brucei AnTat 2.2 while T. equiperdum OVI
seems closely related to T. b. brucei KETRI 2494.
Figure 1. UPGMA homology tree based on the
combined RAPD and MEGA results. Numbers at the nodes are the percentage of
1,000 bootstrap replicates in which these nodes appeared.
Discussion
With the knowledge
obtained from the molecular characterization, we can assume that there are at
least two groups within the T. equiperdum collection. One group is
indistinguishable from T. evansi strains, the other one seems different
from T. evansi but closely related to T. b. brucei. Similar
results were previously observed by Zhang and Baltz (1994) using repetitive DNA
probes. They also found that BoTat 1.1 and OVI were separated from the T.
evansi group while STIB 818 was found within this group. Interestingly, all
strains found in the homogeneous T. evansi / T. equiperdum
cluster score also positive in the PCR RoTat 1.2 while all other Trypanozoon
strains tested are negative in this assay. Taken these data together with
previously obtained serological results (Claes et al, 2002) and the data from
Zhang and Baltz (1994), a new hypothesis can be formulated: The BoTat 1 and the
OVI strains are either true T. b. brucei or they belong to a subspecies
of T. brucei (T. b. equiperdum), while all other T. equiperdum
strains of our study are misidentified and are actually T. evansi.
However, this
study as well as previous studies, are performed using T. equiperdum
populations that have been propagated in laboratory animals for a long time.
There might be a risk that they lost certain “wild type” T. equiperdum
characteristics. Therefore, to confirm the present data, new strains, isolated
from horses with apparent clinical signs of dourine, should be submitted to the
same characterization tests. Potential isolation loci are
If dourine is
considered to be caused by either T. b. brucei or T. evansi a
problem arises on the level of the treatment strategy, since both T. brucei
and T. evansi infections are perfectly curable while for T.
equiperdum there exists an eradication strategy. The only way to tackle
this problem is via controlled experimental infections with confirmed T. equiperdum,
T. evansi and T. b. brucei strains. It would be interesting to
see whether these two groups induce differences in pathology in infected
horses. The differences we found on the molecular and serological level might
be related with differences in the course of the disease, clinical signs,
transmission route, performance of the diagnostic tests, parasite isolation
techniques and the drug sensitivity of the different trypanosomes.
If it can be
proven that all infected horses can be efficiently treated, regardless of the
nature of the infectious agents or the clinical outcome of the infection, it
can be recommended to the OIE to replace the current strategy of eradication by
an appropriate drug treatment. Regarding animal welfare this would be a big step
forward. If, however, it turns out that certain infected horses cannot be
treated efficiently, different scenarios are possible: Is treatment failure
related to the infective strains? Due to tissue tropism of certain
trypanosome strains it might be possible that the administered drugs cannot
reach the target. Here we'll have to look for genetic markers for tissue
tropism. Is treatment failure related to the pathology? Possibly there
is a difference in effectiveness of treatment between acute (virulent strains)
and chronic infections (non virulent strains). In this case it may be useful to
search for possible virulence factors in the infective strains. Is treatment
failure host dependent? Differences in host response may induce drug
inefficiency. This problem is complicated and will demand research into the
immunological defence systems of the different hosts.
Acknowledgments
This
study received financial support from the
Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology in
References
Agbo, E.C., Duim, B., Majiwa, P.A., Buscher, P.,
Claassen, E., te Pas, M.F. 2003. Multiplex-endonuclease genotyping approach
(MEGA): a tool for the fine-scale detection of unlinked polymorphic DNA
markers. Chromosoma. 111, 518-524.
Claes, F., Verloo, D., De Waal, D.T., Urakawa, T.,
Majiwa, P.A., Goddeeris, B.M. and Büscher P., 2002. The expression of RoTat 1.2
Variable Antigen Type in Trypanosoma evansi and T. equiperdum .
Clausen, P-H., Gebreselassie, G., Abditcho, S.,
Mehlitz, D., Staak, C., 1999. Detection of trypanosome DNA in serologically
positive but aparasitaemic horses suspected of dourine in
Clausen, P.H., Chuluun, S., Sodnomdarjaa, R., Greiner,
M., Noeckler, K., Staak, C., Zessin, K.H., Schein, E., 2003. A field study to
estimate the prevalence of Trypanosoma equiperdum in Mongolian horses.
Vet. Parasitol., 115, 9-18.
Ilgekbayeva, G.D., Suleimenov, M.Z., Askarov, K.A.,
1999. New method of serological diagnostics of trypanosomosis (T. equiperdum)
of horses. Conference proceedings of the Second symposium of the newworld on
trypanosomes and other haemoparasites-SSNWTH-Universidad Romulo Gallegos-
Lanham S.M., Godfrey D.G., 1970. Isolation
of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Exp.
Parasitol. 28, 521-534.
Luckins, A.G., 1994. Equine
trypanosomiasis. Eq. Vet. Educ. 6, 259-262.
Stephen, L.E. (Ed.), 1986. Trypanosomiasis. A
veterinary perspective. Pergamon press,
Touratier, L. (2001). Minutes of the 22nd annual
meeting of the OIE ad hoc group on Non Tsetse Transmitted African
Trypanosomes,
Waitumbi, J.N., Murphy, N.B., 1993. Inter- and intra-species
differentiation of trypanosomes by genomic fingerprinting with arbitrary
primers. Mol. Biochem. Parasitol. 58, 181-186.
Zhang, Z.Q., Baltz, T., 1994. Identification of Trypanosoma
evansi, Trypanosoma equiperdum and Trypanosoma brucei brucei
using repetitive DNA probes. Vet. Parasitol. 53, 197-208.
GENETIC
CHARACTERIZATION OF TRYPANOSOMES ISOLATED FROM PIGS IN THE SLEEPING SICKNESS
FOCUS OF BONON, COTE
Ravel S.1,
Koffi M.2, Jamonneau V.1, Cuny G.1 and Solano
P.2
1.Institut de Recherche
pour le développement (IRD), Laboratoire de Recherche et de Coordination sur les Trypanosomoses,
Programme Santé Animale, CIRAD TA207/G,
Campus International de Baillarguet, 34398 MONTPELLIER CEDEX 5 (FRANCE)
2. Centre Pierre Richet, 01
BP 1500 Bouaké, Côte d’Ivoire
Summary
We investigated
the role of domestic pigs as a potential reservoir host for Trypanosoma
brucei gambiense, in the active sleeping sickness focus of Bonon in Center
West Côte d’Ivoire. Since a selective effect of the isolation method has been
suspected, two different methods were simultaneously used to isolate
trypanosomes from pigs: K.I.V.I (Kit for In Vitro Isolation of trypanosomes)
and rodent inoculation. Using isoenzymes, two stocks isolated from the same
animal showed a different pattern according to the isolation method used.
Irrespective of the isolation method, all the pig stocks belonged to a new
group of zymodemes different from both the classical T. b. gambiense
group 1 and the bouaflé group, infecting human patients in this focus.
When using
diagnostic primer sets for T. b. gambiense group 1, only trypanosome
stocks isolated from pigs by K.I.V.I showed the specific T. b. gambiense
group 1 amplification products. All the stocks isolated by rodent inoculation
showed the same banding pattern, but different from the stocks isolated by
K.I.V.I.
These P.C.R
results confirm the selective effect of the isolation techniques and indicate
the presence of T. b. gambiense group 1 in domestic pigs. The discrepancy
between results from isoenzyme analysis and P.C.R technique could be related to
the better sensitivity of the P.C.R tool.
This work also
indicates that pigs could be infected by at least two different trypanosomes of
Trypanozoon subgenus, of which T. b. gambiense group 1 and
another still non-characterized trypanosome, each being selected by the
isolation method. The question about the infectivity of T. b. gambiense
group 1 from pigs to human remains.
Résumé
Au cours d’une étude sur le rôle du porc domestique comme réservoir animal
de Trypanosoma brucei gambiense groupe 1, des trypanosomes ont été
isolés de porcs dans le foyer actif de maladie du sommeil de Bonon, au
Centre-Ouest de la Côte d’Ivoire.
Parce qu’un biais sélectif de la méthode d’isolement était suspecté, deux
méthodes ont été utilisées simultanément pour cet isolement: le KIVI (Kit for
In Vitro Isolation of trypanosomes) et l’inoculation aux rongeurs. En utilisant
les isoenzymes, deux isolats d’un même animal présentaient un profil différent
selon la méthode d’isolement utilisée. D’autre part, tous les isolats de porcs,
quelle que soit la méthode d’isolement, appartiennent à un nouveau groupe de
zymodèmes différents de ceux du groupe 1 de T. b. gambiense et du groupe
bouaflé identifiés chez les malades humains de ce foyer.
En utilisant des amorces PCR diagnostiques de T. b. gambiense groupe
1, seules les souches isolées de porcs par KIVI ont montré les produits
d’amplification caractéristiques de T. b. gambiense groupe 1. En revanche,
tous les isolats obtenus par inoculation aux rongeurs présentaient un même
profil de bandes, différent de celui des isolats par KIVI.
Ces résultats de PCR confirment le biais sélectif de la méthode d’isolement
et montrent la présence de T. b. gambiense groupe 1 chez les porcs
domestiques. La différence entre les résultats obtenus par l’analyse des
isoenzymes et par PCR peut être reliée à une plus grande sensibilité de la PCR.
Ce travail indique aussi que les porcs pourraient être infectés par au
moins deux génotypes de Trypanozoon différents, dont T. b. gambiense
groupe 1 et un autre trypanosome non encore caractérisé, chacun d’eux étant
sélectionné par la méthode d’isolement. La question demeure cependant entière
en ce qui concerne l’infectivité pour l’homme, de T. b. gambiense groupe
1 isolé du porc.
INTRODUCTION
Dans le but d’évaluer l’effet de la méthode d’isolement des trypanosomes
sur la sélection possible de certains génotypes, une étude a été menée sur des
porcs domestiques dans le foyer de maladie du sommeil de Bonon situé au centre
ouest de la Côte d’Ivoire (DIA 2). Dans ce foyer, des malades atteints
de Trypanosomose Humaine Africaine (THA) sont régulièrement diagnostiqués
positifs à Trypanosoma brucei gambiense.
Trypanosoma brucei gambiense (DIA 3), responsable de
la forme chronique de la THA en Afrique de l’Ouest et en Afrique Centrale, a
pu, à l’aide de marqueurs moléculaires, être séparé en 2 groupes. D’une part, Trypanosoma
brucei gambiense groupe 1, qui représente 80% des isolats humains, et Trypanosoma
brucei gambiense groupe 2 ou Bouaflé, groupe très hétérogène qui regroupe
les souches n’appartenant pas au groupe 1.
Depuis maintenant une dizaine d’années, Trypanosoma brucei gambiense
est isolé à partir du sang des malades à l’aide du KIVI (Kit for In Vitro
Isolation of trypanosomes) (DIA 4). Le KIVI est un milieu permettant la
transformation des formes sanguicoles de trypanosomes en formes procycliques,
qui sont facilement cultivables en milieu axénique de Cunningham. Le KIVI a été
mis au point pour pallier les faibles taux d’isolement de Trypanosoma brucei
gambiense par inoculation aux rongeurs, en raison de la faible virulence de
ce parasite pour les rongeurs.
Ces dernières années, avec l’utilisation généralisée du KIVI, une
variabilité génétique très faible est apparue chez les trypanosomes isolés chez
l’homme dans les différents foyers de THA de Côte d’Ivoire (DIA 5).
Ainsi aucune souche du groupe Bouaflé n’a pu être isolée. Il a donc été suggéré
que l’utilisation exhaustive du KIVI pourrait être responsable de la faible
diversité génétique des souches de Trypanosoma brucei gambiense
circulants en Côte d’Ivoire.
Pour étudier cette hypothèse nous avons caractérisé génétiquement et
comparé des souches de trypanosomes issues de porcs domestiques (DIA 6),
isolées simultanément sur KIVI et sur rongeurs. Notre choix s’est porté sur le
porc car l’isolement des trypanosomes par inoculation aux rongeurs présente un
meilleur taux de réussite avec les souches de porc qu’avec des souches
humaines. D’autre part, cette étude nous a permis d’évaluer l’importance du
réservoir animal dans le foyer de THA de Bonon.
Nous avons réalisé cette étude sur 18 porcs domestiques situés dans des
localités où des malades avaient été dépistés. Les porcs ont tous été prélevés
à la veine jugulaire (DIA 7) et leur sang inoculé simultanément sur KIVI
et sur souris (DIA 8). Sept souches de porcs ont pu être isolées à la
fois sur KIVI et sur rongeur; les 14 isolats correspondants ont été
caractérisés génétiquement et comparés (DIA 9). Les isolats issus de
KIVI sont nommés par le numéro du porc suivi de KIVI tandis que les isolats sur
rongeur sont identifiés par le numéro du porc suivi de RI (pour rodent
inoculation).
Chaque isolat a tout d’abord été analysé par isoenzymes en utilisant 10
systèmes enzymatiques représentant 13 loci. Les résultats de cette analyse sont
présentés sur ce dendrogramme (DIA 10). Nous observons que pour les 7
porcs, les 2 isolats d’un même porc (KIVI et RI) présentent un profil
différent. D’autre part, tous ces isolats de porc, quelle que soit la méthode
d’isolement utilisée, appartiennent à des zymodèmes différents des zymodèmes du
groupe 1 de Trypanosoma brucei gambiense et proches de ceux du
groupe Bouaflé.
Dans un deuxième temps, ces 14 isolats (2 pour chaque porc) ont été
analysés par PCR à l’aide d’amorces diagnostiques de Trypanosoma brucei
gambiense groupe 1. Nous avons tout d’abord utilisé le couple d’amorces
TRBPA1/TRBPA2 pour lequel la présence d’une bande à 149 bp signe un Trypanosoma
brucei gambiense groupe 1 (DIA 11, gel). Lorsque les isolats de porc
ont été soumis à la PCR par ce couple d’amorces, de nombreux produits
d’amplification, absents avec les ADN de référence et les isolats de malades du
même foyer, ont été observés de façon reproductible avec tous les isolats (DIA
11, gel). (Les expériences de PCR ont en effet été répétées jusqu’à 8
fois). La bande à 149 bp diagnostique de Trypanosoma brucei gambiense
groupe 1 a été amplifiée chez 5 isolats provenant de KIVI, au minimum une fois
sur 7 expériences et au maximum 4 fois sur 8, tandis qu’elle n’a été observée
qu’une seule fois sur 7 chez un seul isolat provenant de l’isolement sur
rongeur (DIA 12, table). Trois bandes à 179, 185 et 191 bp ont été
retrouvées de façon reproductible chez 6 isolats issus de rongeurs. Ces bandes
ont été séquencées: elles contiennent toutes le motif répété GAACCT présent
dans la bande diagnostique à 149 bp et diffèrent en taille uniquement par le
nombre de répétition de ce motif. Les profils d’amplification diffèrent entre
isolats KIVI et isolats rongeurs chez 5 porcs sur 7.
Nous avons également amplifié ces 14 isolats à l’aide du couple d’amorces M6C8F/M6C8R décrit par Biteau et al., pour lequel la bande diagnostique de Trypanosoma brucei gambiense groupe 1 se situe à 85 bp (DIA 13, table). Cette bande a été détectée chez tous les isolats issus de KIVI, au minimum une fois sur 4 (pour l’isolat 21) et au maximum 2 fois sur 3 (pour l’isolat 17) mais chez un seul isolat issu de rongeur, 1 fois sur 4. Deux autres bandes, à 120 et 126bp, ont été amplifiées de façon reproductible chez tous les isolats issus de rongeur a