DES NOUVEAUX MARQUEURS MICROSATELLITE POUR LA CARACTERISATION DE TRYPANOSOMA BRUCEI S.L., CONSEQUENCES EN TERMES DE DIAGNOSTIC ET DE CLINIQUE 

CHARACTERISATION OF TRYPANOSOMA BRUCEI S.L. USING NEW MICROSATELLITE MARKERS : DIAGNOSTIC AND CLINICAL CONSIDERATIONS

M. Koffi^1,2, P. Solano², D. Courtin^{1, 3}, A. Garcia³, G. Cuny¹ & V.Jamonneau¹*

¹Institut de Recherche pour le Développement (IRD), Unité de Recherche 035, Laboratoire de Recherche et de Coordination sur les Trypanosomoses, Montpellier, France
²IRD, UR 035, Centre Pierre Richet, Bouaké / Abidjan, Côte d’Ivoire
³IRD, UR 010, Dakar, Sénégal

            Studies on the genetic characterization of T. brucei s.l. have always been difficult and often unrealistic, notably because of selection of trypanosome populations after in vivo and in vitro isolation and culture, which renders unsuccessful genetic distinguishing by available tools.  However, direct and indirect arguments are in favour of associations between the genetic variability of the parasite and the diversity of responses to the infection.  For instance, we observed that multiple  infections in humans were consistent with a particular form of the disease characterisedcharacterized by a very low parasitaemia, a positive serological response and an asymptomatic clinical pattern.  In order to identify these host / parasite interactions which could have important implications in term of diagnosis and epidemiology, a comprehensive characterization of the natural trypanosome populations is needed, taking into account the need of characterizing trypanosomedirectrly from the biological fluids.  In this study, new microsatellite markers were identified in the available T.brucei genomes databases and were tested and trypanosome reference stocks and on isolated stocks and blood samples from both sleeping sickness cases and seropositive but apparently aparasitemic individuals from Côte d’Ivoire.  These primers could contribute in studying the role of the genetic diversity of the parasite in both the diversity of responses to the diagnostic tests and the diversity of clinical features.

            Les études sur la caractérisation génétique de T. brucei s.l. ont toujours été difficiles et souvent peu réalistes, en particulier à cause de la sélection des populations de trypanosomes après l’isolement et la culture in vivo et in vitro, qui rend complexe l’identification des entités génétiques avec les outils disponibles. Cependant, des arguments montrent qu’il existe des corrélations entre la variabilité génétique des trypanosomes et la diversité des réactions à l’infection. Par exemple, nous avons observé que des infections multiples chez l’homme pouvaient être responsables d’une forme particulière de la maladie caractérisée par une très faible parasitémie, une réaction sérologique positive et un type clinique asymptomatique. Afin de mener une étude plus poussée sur ces interactions hôte/parasite, qui pourraient avoir d’énormes conséquences en termes de diagnostic et d’épidémiologie, une caractérisation précise des populations naturelles de trypanosomes est nécessaire et pour ce faire, il faudrait caractériser les trypanosomes directement à partir des liquides biologiques. Dans cette étude, de nouveaux marqueurs microsatellites ont été identifiés à partir de la banque de données du génome de T. brucei. Ils étaient testés sur des souches de référence et sur des souches isolées de trypanosome, et sur des échantillons de sang de malades sommeilleux et de sujets séropositifs mais ne souffrant pas de parasitémie en Côte d’Ivoire. Ces amorces pourraient contribuer à l’étude du rôle de la diversité génétique du parasite dans la diversité de réactions aux tests de dépistage et dans la diversité clinique.

1.         Introduction

            La lutte contre la Trypanosomose humaine africaine (THA) repose essentiellement sur le dépistage et le traitement des malades. Malheureusement, les techniques actuellement utilisées manquent souvent de sensibilité (due aux parasitémies faibles et fluctuantes pour les examens parasitologiques, et dans le cas d’infections précoces ou d’infections qui ne produisent pas les anticorps recherchés pour les tests sérologiques) et/ou de spécificité (réactions croisées avec d’autres trypanosomes ou d’autres parasites humains pour les tests sérologiques). Ainsi, trois catégories de sujets sont présents en zone d’endémie : des sujets sains (négatifs aux tests sérologiques et parasitologiques), des malades (positifs à ces mêmes tests) dont l’évolution clinique est très variable, et des sujets porteurs d’anticorps chez qui le parasite ne peut être mis en évidence. On parle dans ce dernier cas de séropositivité sans confirmation parasitologique (Garcia et al., 2000).

            La diversité clinique (Ginoux & Frézil, 1981; Jamonneau et al., 2002 ; 2004 ; Truc et al., 1997 ; Garcia et al., 2000) et la diversité de réponses aux tests de dépistage (Noireau et al., 1986 ; Garcia et al., 2000) témoignent d’une importante diversité de réponses à l’infection liée à des interactions complexes hôte/parasite. L’origine de cette diversité doit être recherchée à la fois chez le parasite (variabilité génétique) et l’hôte (prédisposition à développer la maladie). Concernant le parasite, la différenciation sub-spécifique de T. brucei s.l.  (T. b. gambiense responsable d’une forme chronique en Afrique de l’Ouest et Centrale, T. b. rhodesiense, responsable d’une forme aiguë en Afrique de l’Est et T. b. brucei non pathogène pour l’homme) basée sur des critères extrinsèques (répartition géographique, hôtes et formes cliniques) semble insuffisante face, par exemple, à la diversité clinique observée. Si l’on se réfère à des caractères plus intrinsèques liés aux trypanosomes (marqueurs moléculaires : isoenzymes, RFLP), les mêmes difficultés apparaissent ; l’individualisation des différentes sous espèces en tant qu’entités génétiques distinctes reste douteuse.

            En fait, l’étude de la variabilité génétique des trypanosomes rencontre un certain nombre d’obstacles. Un biais sélectif des techniques d’isolement mis récemment en évidence (Jamonneau et al., 2003) remet en cause les résultats obtenus en génétique des populations, essentiellement basés sur l’utilisation d’outils moléculaires nécessitant des étapes d’isolement: Kit for in vitro isolation (KIVI) et isolement sur rongeur (IR). Parallèlement, l’existence d’infections multiples semble se confirmer (Truc et al., 2002 ; Jamonneau et al., 2004).

            Dans cette étude, nous visons l’identification précise des trypanosomes circulant dans les foyers de THA en Côte d’Ivoire, en tenant compte de l’existence du biais sélectif des techniques d’isolement, et en mettant un accent particulier sur l’existence d’infections multiples. Cette étape nécessite la mise au point technique d’un outil permettant d’identifier les parasites directement dans les liquides biologiques (sang, lymphe et LCR) : les marqueurs microsatellites. Le but principal est de pouvoir utiliser ces nouveaux marqueurs dans l’étude de l’influence de la variabilité génétique de T. brucei s.l. sur la diversité de réponses à l’infection.

2.         Matériel et méthodes

2-1.      Stocks

            Pour tester la sensibilité et la spécificité de nouvelles amorces sélectionnées, nous avons utilisé (voir Tableau 1) :

- 6 stocks provenant de 3 malades (2 stocks ont été isolés pour chacun des 3 malades, l’un sur KIVI et l’autre par IR),
- 3 stocks isolés uniquement par KIVI,
- 4 stocks isolés uniquement par IR,
- 10 stocks de référence (ref) appartenant aux différentes sous espèces de T. brucei s.l. (3 T. b. gambiense groupe 1, 3 T. brucei brucei, 3 T. bouaflé groupe et 1 T. brucei rhodesiense) et un stock de T. congolense
- 3 échantillons de sang total provenant des malades (T+),
- 4 échantillons de sang total provenant des sujets séropositifs (S+) .
L’extraction d’ADN a été faite en utilisant le DNeasy tissue kit (Qiagen).

Tableau 1 : Stocks sélectionnés pour tester les nouveaux marqueurs

2-2.      Sélection des microsatellites et amplification de l’ADN

            Six nouvelles amorces microsatellites définies dans notre laboratoire (Mic-BG1, Mic-BG4, Mic-BG5, Mic-BG6, Misat-G8 et Misat-G9, Tableau 2) à partir de la base de données du séquençage de T. brucei et 2 autres amorces microsatellites (M6C8 et MT3033, Biteau et al., 2000), et un multicopie gène (TRBPA1/2, Truc et al., 2002) ont été sélectionnés pour identifier les stocks sélectionnés. L’amplification PCR s’est faite dans un thermocycleur PTC-100TM (MJ Research Inc., Etats-Unis): 3 min à 95°C, 2 cycles de 45 s à 95°C, 45 s à 60°C et 45 s à 72°C, suivi de 38 cycles de 45 s à 95°C, 45 s à 55°C et 45 s à 72°C, et enfin 5 min à 72°C. La solution d’amplification est préparée dans un volume final de 50 µl contenant 10 pmol de chaque amorce, 0.2 mM de chaque dNTP, 1x de tampon d’incubation, 1.5 mM de MgCl2, 0,5 U de Taq polymerase (QBIOgene, Ilkirch, France) et 10 µl de solution d’ADN extrait. 15 µl du produit d’amplification sont mis à migrer sur gel d’acrylamide 10% qui permet de séparer les allèles à deux paires de base près.

2-3 Lecture des profils

Tableau 2 : Présentation des nouvelles amorces microsatellites testées : séquence, motifs répétés, nombre d’allèles observés sur l’ensemble des souches testées et taille des allèles observées (de la plus petite à la plus grande)

            Dans les marqueurs microsatellites, chaque zone de répétition est un locus et chaque nombre de répétition est un allèle. Si le locus est polymorphe, les individus différents auront un nombre de répétition du motif différent et donc des tailles (allèles) différentes. Les tailles d’allèles sont déterminées grâce à différents marqueurs de tailles. Dans les tableaux 2, 3 et 4, les tailles d’allèle sont données en nombre de paires de base.

3.         Résultats

3-1       Marqueurs microsatellites : plus de polymorphisme engendré

            Toutes les nouvelles amorces testées et principalement Mic-BG1 et Misat-G9 avec respectivement 21 et 19 profils alléliques différents ont montré du polymorphisme (Tableau 2). Mic-BG4 est l’amorce qui a montré le moins de polymorphisme avec seulement 4 allèles différents observés. Les amorces M6C8, MT30/33 et TRBPA1/2 ont confirmé leur intérêt dans ce type d’étude avec respectivement (données non présentées dans le Tableau 2) 15, 25 et 19 allèles différents (Biteau et al., 2000 ; Truc et al., 2002). Le stock de référence T. congolense n’a pas montré de produits d’amplification. De manière générale, une importante variabilité a été mise en évidence au sein de T. brucei s.l. avec une grande hétérogénéité entre les stocks de référence de T. b. brucei, T. b. rhodesiense et du groupe bouaflé. Tous les stocks exhibant l’allèle à 149 pb avec TRBPA1/2 ont été définis comme appartenant à T. b. gambiense groupe 1 (Truc et al., 2002). Comme avec les autres marqueurs classiques (isoenzymes, RFLP), ce groupe 1 de T. b. gambiense est apparu homogène. Néanmoins, les marqueurs microsatellites ont engendré plus de polymorphisme que ces marqueurs classiques au sein de ce groupe. Par exemple, des stocks appartenant au zymodème 3 (défini par les isoenzymes) de T. b. gambiense groupe 1 ont montré des profils alléliques différents.

3-2       Confirmation du biais sélectif des techniques d’isolement

            Les profils alléliques obtenus avec les amorces M6C8, MT30/33 et Misat G9 montrent des différences entre 2 stocks isolés du même patient par 2 techniques d’isolement (KIVI et IR) (Tableau 3). Le fait d’avoir obtenu plus de polymorphisme avec les échantillons biologiques (Tableau 4) qu’avec les stocks isolés (Tableau 3) est aussi en faveur d’un biais sélectif des techniques d’isolement.

3-3       Importance du typage direct, comparaison malades/séropositifs

            Les résultats obtenus sur les ADN extraits directement du sang de malade (T+) et de sujets séropositifs (S+) montrent des profils différents avec plusieurs amorces entre ces 2 types de sujets (Tableau 4).

Tableau 3 : Comparaison entre les stocks isolés des 3 malades avec 2 techniques d’isolement          (KIVI et IR)

4          Discussion

            Les marqueurs microsatellites testés semblent spécifiques de T. brucei s.l.; des produits d’amplification ont été obtenus pour tous les individus de l’espèce T. brucei s.l., mais pas pour le stock de T. congolense, ce qui confirme bien l’importante distance génétique qui existe entre les sous genres Nanomonas et Trypanozoon. Une étude de spécificité vis-à-vis d’autres parasites comme Plasmodium falciparum, Loa loa, Leishmania s.l., T. cruzy et les autres trypanosomes du sous-genre Trypanozoon (T. equiperdum et T. evansi) est en cours.

            Les amorces microsatellites ont confirmé l’hétérogénéité qui existe au sein de l’espèce T. brucei s.l. avec notamment des profils très différents entre les stocks des sous-espèces T. b. brucei et T. b. rhodesiense et ceux du groupe bouaflé. Elles confirment aussi, au sein de cette hétérogénéité, l’homogénéité du groupe 1 de T. b. gambiense. Néanmoins, les amorces utilisées ont permis de mettre en évidence au sein de ce groupe, plus de polymorphisme que les marqueurs classiques, ce qui permettra ultérieurement de rechercher d’éventuelles corrélations entre la diversité génétique mise en évidence par ces amorces, et la diversité clinique.

            La différence de profils alléliques entre stocks isolés du même patient par différentes techniques d’isolement confirme le biais sélectif de ces techniques (Jamonneau et al, 2003) et confirme l’existence d’infections mixtes chez l’homme qui avaient déjà été suspectées lors des études antérieures (voir Jamonneau et al., 2004). Le plus grand polymorphisme observé sur les échantillons biologiques comparés aux stocks isolés (par KIVI ou IR) confirme aussi ce biais sélectif. Ces résultats pourraient remettre en cause ceux des études antérieures sur la diversité génétique des trypanosomes qui se sont essentiellement basées sur des stocks isolés. Dans tous les cas, ils confirment la nécessité de caractériser les trypanosomes directement à partir des liquides biologiques de l’hôte, et confirment donc l’intérêt des amorces microsatellites. En effet, toutes les amorces testées se sont montrées assez sensibles pour détecter et identifier les trypanosomes circulant dans le sang des malades. Certains séropositifs ont aussi pu être amplifiés. Les profils obtenus pour ces sujets montrent plus de polymorphisme et sont différents de ceux obtenus pour les malades.

            Il semblerait donc sur la base de ces résultats préliminaires, que les trypanosomes circulant chez les individus séropositifs (qui se caractérisent par des parasitémies trop faibles pour être détectés par les techniques parasitologiques et par l’absence de signes cliniques) soient différents de ceux que l’on retrouve chez un malade « classique ». Ceci semble en faveur d’un rôle important de la diversité génétique des trypanosomes dans la diversité de réponses à l’infection et confirme l’intérêt des amorces microsatellites, d’une part dans l’étude de la diversité génétique des trypanosomes pathogènes pour l’homme et d’autre part dans l’épidémiologie de la THA.

            Outre les études de spécificité des amorces utilisées, nous recherchons actuellement d’autres amorces informatives, afin de pouvoir mettre en place une étude de génétique des populations des trypanosomes circulant dans les liquides biologiques humains, le sang, mais aussi le LCR et la lymphe. Des différences entre trypanosomes du sang et du LCR sont suspectées (Truc et al., 2002), peut-être que les amorces microsatellites permettront de les confirmer.

Tableau 4 :  Résultats obtenus sur les échantillons biologiques (sang total) des malades (T+) et séropositifs (S+)

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