UN TEST DE DIAGNOSTIC RAPIDE POUR LA DETECTION ET LA SURVEILLANCE SUR LE TERRAIN  DE  LA RESISTANCE AUX TRYPANOCIDES DANS LES ZONES COTONNIERES DE L’AFRIQUE DE L’OUEST

A RAPID DIAGNOSTIC TEST FOR FIELD  DETECTION AND SURVEILLANCE OF  TRYPANOCIDE RESISTANCE IN COTTON ZONE OF WEST AFRICA

O. Diall1, P-H Clausen2, B. Diallo3, S. Muenstermann4, Z. Bocoum5, A. Djitteye5, B. Diarra6, A.M. Barry4, I. Sidibé7, D. Grace2, E. Talaki7   ,H. Affognon8, T.F. Randolph9 & J.J. McDermott9

1 ILRI/BMZ Project on Chemoresistance, ICRISAT-Mali, Bamako, Mali
2 Freie Universitaet Berlin, Berlin, Germany
3 Laboratoire Central Vétérinaire de Bamako, Bamako, Mali
4 Unité Centrale de Lutte contre les Tsé-tsé et la Trypanosomose, Bamako, Mali
5 International Trypanotolerance Center, Banjul, The Gambia
6 Institut de Recherche Agronomique de Guinée (IRAG), Conakry, Guinea
7 Centre International de Recherche-Développement sur l’Elevage en Zone Subhumide (CIRDES),   Bobo Dioulasso, Burkina Faso
8 University of Hannover, Hannover, Germany
9 International Livestock Research Institute (ILRI), Nairobi, Kenya

Summary

            Trypanocide resistance has become a major handicap to the control of bovine trypanosomosis in West Africa. It is therefore important that relevant national institutions are prepared for detection and surveillance of chemoresistance in the field.  The recent evaluation of trypanocide chemoresistance conducted in Mali and Burkina was based on a 56-day protocol. The analysis of generated data suggested that even a 28- day observation could be sufficient to get significant results. Thus a 28-day protocol was developed and tested in 17 villages in Mali for detection of trypanocide resistance.

            This protocol comprises parasitological controls on days 14 and 28 after preventive treatment with isometamidium (1mg/kg) of 40-50 cattle, compared with a control group. During the follow up, all infections monitored in both groups were treated with Diminazène (3.5mg/kg)

            Resistance to Isometamidium was assessed by comparing cumulative incidences (CI) in both treatment and control groups using the test Relative Risk Reduction (RRR) and deducting the rate of treatment failure.  Resistance to Diminazène was assessed through the rate of treatment failures observed at 14 days post treatment in the control group. In both case the threshold of 25% treatment failure was adopted as criteria of presence of chemoresistance. This shortened test has revealed different levels of drug resistance in the surveyed villages, and allowed economies in time and resources. 

Key words: trypanosomosis, chemoresistance, cotton zone of West Africa

            La résistance aux trypanocides  est devenue  un handicap majeur aux efforts de lutte contre la trypanosomose bovine en Afrique l’Ouest.  Il devient alors important que les services nationaux concernés soient en mesure d’assurer la détection et la surveillance continue du phénomène sur le terrain.  Les récentes évaluations de la résistance aux trypanocides réalisées au Mali et au Burkina ont été basées sur un protocole de 56 jours.  L’analyse des résultats de ces évaluations a permis de suggérer qu’une période d’observation de 28 jours serait suffisante pour obtenir des résultats significatifs. Un protocole de 28 jours a donc été développé et testé dans 17 villages du Mali pour détecter  des résistances aux trypanocides. 

            Ce protocole comporte seulement deux examens parasitologiques de contrôle: les 14ème et 28ème jours après le traitement préventif avec 1mg/kg d’isometamidium d’un lot de 40-50 bovins, comparé avec un lot témoin.  Au cours du suivi, toutes les infections enregistrées dans les deux groupes ont été traitées au Diminazène (3.5 mg/kg).

            La résistance à l’Isometamidium a été évaluée par la comparaison des incidences cumulées (IC) des infections dans les groupes traité et témoin, en utilisant  le test de  réduction relative du risque (RRR) et en déduisant le taux d’échecs de traitement.  La résistance au Diminazène a été évaluée en fonction des rechutes observées, 14 jours après les traitements curatifs  dans le groupe témoin.  Dans les deux cas, le seuil de 25% d’échecs de traitement a été adopté pour affirmer la présence de résistance. Cette épreuve raccourcie a permis de mettre en évidence différents niveaux de chimiorésistance dans les villages étudiés,  permettant une économie de temps et de moyens. 

Mots-clés : trypanosomose, chimiorésistance, zone cotonnière d’Afrique de l’Ouest

1. Introduction

            Dans les zones cotonnières de l’Afrique de l’Ouest, l’agriculture, au sens strict du terme, constitue la principale activité économique, avec le coton comme produit phare.  L’élevage de bovin constitue le moteur de cette économie ; il fournit des bœufs pour les travaux agricoles et le transport des intrants, de la fumure pour la fertilisation des sols,  et  constitue un moyen d’épargne et de capitalisation des revenus tirés de la vente du coton.

            La trypanosomose animale africaine constitue la principale contrainte sanitaire  au développement de cet élevage.  La gravité de cette pathologie, qui n’y est pas nouvelle, s’est considérablement accrue avec l’introduction du zébu pour répondre à la demande en force de traction exprimée par les producteurs de coton. 

            Le remplacement progressif du bétail autochtone par le zébu, a considérablement augmenté la dépendance des élevages et des bœufs de labour vis-à-vis des traitements trypanocides et encouragé leur pratique par les paysans eux-mêmes, partout où les services d’un vétérinaire ne sont pas disponibles.   En effet, les traitements trypanocides y constituent la principale, et souvent la seule stratégie utilisée dans la lutte contre la trypanosomose animale. 

            Après plusieurs décennies d’utilisation des trypanocides disponibles, le diminazène comme curatif et l’isometamidium essentiellement comme préventif, le développement de la chimiorésistance apparaît aujourd’hui comme l’obstacle majeur à la poursuite de ces traitements. 

            En effet, plusieurs études menées dans la sous-région ont confirmé l’existence de la chimiorésistance des trypanosomes, d’abord  au Burkina Faso et plus récemment au Mali (Authié, 1984 ; Clausen et al., 1992 ; McDermott et al., 2003 ; Diall et al, 1993). 

            Le diagnostic et la surveillance constituent une composante essentielle de toute stratégie de lutte contre la chimiorésistance. Les services nationaux de recherche et de développement à qui incombe cette tâche devront donc disposer  d’un outil simple d’évaluation de la résistance aux trypanocides  et être formés à son utilisation.

            Dans la pratique, la suspicion de résistance est éveillée par l’inefficacité apparente d’un traitement trypanocide. Mais sa confirmation fait  appel à des tests de laboratoire tels que :

• le dosage du trypanocide dans le sang pour pouvoir affirmer que le traitement est inopérant, malgré une concentration suffisante du médicament;
• la culture in vitro ou in vivo des souches de trypanosomes isolées sur le terrain en présence de concentrations croissantes du médicament ;
• l’application du test PCR pour détecter des marqueurs génétiques de résistance sur des isolats de trypanosomes en utilisant des amorces spécifiques
• enfin, la réalisation sur le terrain, d’enquêtes  collectives, basées sur le traitement et le suivi des infections chez des animaux naturellement exposés;

Cette dernière approche a été utilisée par Rowlands et al. (2000) pour évaluer la résistance au diminazène et par Eisler et al. (2000) pour évaluer la résistance à l’isometamidium

            Le test de Eisler a été appliqué avec succès par Tewelde et al. (2003) en Ethiopie et  par McDermott  et al. (2003) au Burkina Faso.   Ce test est basé sur la comparaison des taux d’incidence des infections dans deux groupes de bovins naturellement exposés dont l’un est traité à l’isometamidium et l’autre, non traité servant de témoin.  Le suivi des infections dure 8-12 semaines.  Cependant, les protocoles  basés sur un suivi prolongé des animaux représentent une contrainte majeure pour la participation des producteurs et augmentent le nombre de défections en cours d’expérience.

            S’appuyant sur ces études antérieures, la présente se propose de développer un test rapide pour un diagnostic simultané de la résistance à l’isometamidium et au diminazène sur le terrain.  Il  raccourcit, de moitié, le test de Eisler  et le complète par une évaluation des échecs de traitement au diminazène.  

2. Matériel et méthodes

            Trois études, sur la résistance, ont été réalisées dans le sud du Mali, dans une zone cotonnière  comprenant les cercles de Sikasso, Bougouni et Yanfolila.

Etude 1 : Sikasso Est

            Cette étude a été menée en deux phases ; la première phase est une enquête transversale qui s’est déroulée entre septembre et octobre 2002, avec pour objectif de recueillir des informations sur la prévalence de la trypanosomose et les espèces et la densité de tsé-tsé.  La deuxième phase a consisté en une enquête longitudinale destinée à évaluer les niveaux de chimiorésistance dans les sites où le risque d’infection est considéré comme élevé (prévalence de 10% ou plus), selon les résultats de l’enquête transversale.

Enquête transversale

            Elle s’est déroulée dans 25 sites tirés par échantillonnage systématique sur une liste d’une centaine de sites. Dans chaque site, un échantillon de 50 bovins âgés de plus d’un an, a été choisi au hasard. Sur chaque animal, du sang a été prélevé à la jugulaire dans un tube vacutainer hépariné, et la recherche de trypanosomes effectuée par la méthode du « Buffy coat »  ( Murray et al. 1977).

            Pour les données entomologiques, dix (10) pièges de capture de type Challier- Laveissière ont été placés par localité et par type d’habitat (galerie et savane) pendant 24 heures.

Enquête longitudinale

            L’étude s’est déroulée entre novembre 2002 et janvier 2003 dans 5 sites à forte prévalence identifiée grâce à l’enquête transversale. Dans chacun de ces sites, 100 bovins ont été choisis et identifiés avec des boucles numerotées, puis  répartis au hasard entre un groupe à traiter à l’isometamidium et  un groupe sans traitement. A J0, tous les animaux ont été testés pour la présence de trypanosomes et une lecture des hématocrites a été effectuée ; le même jour, les 50 bovins du groupe traité ont reçu une injection intramusculaire d’isometamidium à 1mg/kg  de poids vif, tandis que les positifs parasitologiques du groupe témoin recevaient une injection intramusculaire de diminazène à la dose de 3,5mg/kg de poids vif.  Toutes les deux semaines, des examens parasitologiques de contrôle, avec lecture des hématocrites, sont effectués sur les deux groupes et  les positifs des deux groupes sont traités au diminazène. Ce suivi a duré 8 semaines. 

Etude 2 : Sikasso Est

            L’étude 2 s’est déroulée entre mars et avril 2003 et a consisté en une enquête longitudinale d’évaluation de la chimiorésistance dans 9 sites choisis à proximité des 5 sites ayant fait l’objet d’enquête dans l’étude 1. Cette deuxième étude se distingue de la première par un suivi de plus courte durée, 4 semaines au lieu de 8, et par  un échantillon de plus petite taille, 40 bovins/groupe au lieu de 50 ;  toutes les autres conditions sont restées les mêmes.

Etude 3 : Sikasso Ouest,  Bougouni, Yanfolila 

            Tout comme l’étude 1, l’étude 3 a commencé par une enquête transversale pour évaluer les prévalences, qui s’est déroulée entre avril et juillet 2004 dans 34 sites, suivie d’une enquête longitudinale pour évaluer la chimiorésistance dans 3 sites ; ces enquêtes ont été conduites  dans les mêmes conditions que dans l’étude 1

Analyse des données

            Dans les enquêtes transversales, on a calculé les prévalences des infections pour pouvoir identifier les sites à forte prévalence (P>­10%), qui seront soumis à l’évaluation de la chimiorésistance.  Les densités de tsé-tsé ont été  également déterminées essentiellement pour actualiser les connaissances et alimenter une base de données sur la trypanosomose et la chimiorésistance dans la région.

            Pour l’évaluation de la résistance à l’isometamidium, on  effectue une comparaison des taux d’incidence des infections dans les deux groupes, traité et témoin.  Eisler (2000) a comparé les risques d’infection dans les deux  groupes, en divisant le risque dans le groupe témoin par le risque dans le groupe traité.  Il a suggéré que la résistance à l’isometamidium soit suspectée lorsque ce rapport est inférieur à 2 ; ceci équivaut à une réduction du risque d’infection dans le groupe traité de moins de 50% par rapport au groupe témoin. Une autre alternative proposée par Eisler est de suspecter la résistance lorsque la proportion de sujets infectés dans le groupe traité dépasse le seuil de 25%.

            L’analyse préalable d’une batterie de tests statistiques (Grace,2005 ) nous a amené à  choisir une démarche qui consiste à calculer la Réduction Relative du Risque  et de son intervalle de confiance  95% ;  à partir de la borne inférieure de l’intervalle, on détermine le taux maximal de protection  conféré par l’isometamidium et on en déduit le taux minimal d’échecs correspondant. Un taux d’échecs de 25% est considéré par l’OMS (2004), comme la limite tolérable pour la chloroquine dans le traitement du paludisme.  Ce même seuil  a été adopté dans cette étude pour l’isometamidium.

            Dans les études 1 et 3, où l’évaluation de la chimiorésistance a duré 8 semaines, l’analyse des données a été réalisée en deux temps, 28 jours et 56 jours, pour les besoins de comparaison. 

            En ce qui concerne le diminazène,  son efficacité est évaluée, en fonction des taux de rechutes observés 14 jours après les traitements curatifs (3,5mg/kg) dans le seul groupe témoin, durant la période de suivi.  Là également, le taux d’échecs de 25% est adopté comme la limite tolérable.

3. Résultats:

Etude 1 : Sikasso Est

Enquête transversale pour identifier les sites à forte prévalence :

            Au total, 77 infections ont été décelées sur 1238 bovins examinés par le BCT dont 52 infections dues à Tc (67,5%) et 25 infections dues à Tv (32.5%) ; soit une prévalence moyenne de 6,2% ; Au total, 28% des sites étudiés (7 sur 25) ont une prévalence  supérieure à 10%.  Sur ces 7 sites, 5 ont été choisis pour l’enquête longitudinale.

            Les résultats des captures ont montré que  G.p.gambiensis, avec 684 mouches capturées, est l’espèce dominante,  suivie de  G. tachinoides avec 61 mouches capturées par les 250 pièges. La densité apparente (DAP) moyenne, toutes espèces riveraines confondues, est d’environ 3.

            La seule espèce de savane, G.morsitans submorsitans,  historiquement présente dans la région  a  été absente des captures.

Tableau 1 : Résultats de l’enquête longitudinale (étude1) analysés sur 28j

Enquête longitudinale pour évaluer la chimiorésistance :

            Dans cette épreuve de 56 jours, les résultats ont été analysés sur 28 jours (Tab 1) et sur 56 jours (Table 2).

            Sur une durée de 28 jours, la proportion d’animaux infectés a varié de 0 à 18,4% pour les groupes traités et de 0 à 34% pour les groupes non traités.  Le risque nul dans le groupe traité à Bamadougou et dans le groupe témoin à Kafoziela n’a pas  permis d’effectuer pour ces sites, les calculs prévus.

            Le calcul de la Réduction du Risque Relatif à révélé des taux d’échecs  de 3%, 26,7% et 41% pour les sites de Farako, Tiogola et Diassadiè, respectivement. 

            Les deux derniers sites ayant  des taux d’échecs supérieurs à 25% sont donc considérés comme des foyers de résistance à l’isometamidium.

            L’analyse sur une période de 8 semaines (56 jours), a fourni des  taux d’échecs en général plus élevés et permis d’évaluer le site de Bamadougou et de Kafoziela, grâce à la survenue de nouvelles infections. Les taux obtenus sont de 2%, 24,6%, 30,5%, 34,6% et 35% pour les sites de Bamadougou, Kafoziela, Tiogola, Farako et Diassadiè, respectivement.  Les sites de Bamadougou et de Kafoziela sont  les seuls  à présenter un taux inférieur au seuil de 25%. 

Tableau 2 : Résultats de l’enquête longitudinale (étude1) analysés sur 56j

Etude 2 :

            Sur les 9 sites évalués par le protocole de 28 jours (Tab 3), 1 seul ( Bogotiéré) a été sorti de l’analyse pour un risque d’infection nul dans les deux groupes. Les 8 autres ont donné les taux d’échecs suivants : 2% (Samogosoni), 4,7% (Badiassa), 17,3% (Finkolo), 18,9% (Niangasoba), 34,9% (Wahibéra) 35,8% (Nianankorodougou),  36% (Kapala) et  38,7% ( Finibougou).  Les quatre derniers sites ayant des taux supérieurs au seuil de 25%, sont considérés comme des foyers de résistance à l’isometamidium. 

Etude3 : Sikasso Ouest, Bougouni, Yanfolila

Enquête transversale 

            La prévalence dans les 34 sites étudiés  a varié entre 0 et 13% avec un total 78 cas dont 24  de T.congolense, 53  de T.vivax et 1 seul de T. brucei.

            En ce qui concerne le vecteur, les 340 pièges ont capturé 714 mouches dont 535 de G.palpalis gambiensis et 179 de G. tachinoides, soit une DAP moyenne de 2,1

            A l’issue de cette enquête, seul le site de Faraba à  Bougouni a montré une prévalence élevée (11,6%). Mais l’enquête s’étant déroulée à une période de faible transmission (mai-juillet), 2 autres sites à prévalence moyenne (5,6% et 5%) ont été ajoutés à Faraba pour l’évaluation de la chimiorésistance. Ces sites sont Chobougou (Niena/Bougouni) et Sanana (Yanfolila).

Enquête longitudinale pour évaluer les niveaux de résistance

            Sur 28 jours,  le risque s’est avéré insuffisant à Chobougou pour l’analyse, tandis que les 2 autres sites ont montré des taux d’échecs de 17% (Sanana) et  21% (Faraba), inférieurs au seuil de 25%. 

            L’analyse effectuée sur 56 jours a permis grâce à l’accroissement de la proportion de sujets infectés d’obtenir des taux d’échecs plus élevés et d’inclure Chobougou dans l’analyse.  Ces taux sont de 30% (Sanana), 31% ( Faraba ) et 48% (Chobougou).

Résistance au Diminazène

            Les taux de rechute 14 jours après traitement vont de 0 à 37,5%. Mais le nombre des traitements est généralement faible.  Le site de Tiogola où le nombre de traitements au diminazène est le plus élevé dans le groupe témoin, a montré un taux d’échec  37,5% (13,8-61,2%), ce qui en fait un site où la résistance au diminazène mérite d’être surveillée. 

Tableau 3: Enquête longitudinale pour évaluer la chimiorésistance dans un test de 28 jours :

4.         Discussion

            En utilisant les enquêtes transversales comme  première étape dans  l’évaluation de la chimiorésistane, on peut  générer des informations de base sur le risque d’infection, sur la fréquence des  espèces de trypanosome et de tsé-tsé, ainsi que d’autres. Ces informations permettent d’actualiser ou de compléter les connaissances sur la Trypanosomose selon les cas.

            Dans la présente étude, les enquêtes transversales ont révélé de grandes disparités dans les prévalences entre différentes zones et entre sites à l’intérieur de la même zone. Ainsi dans la zone de Sikasso Ouest, Bougouni et Yanfolila, il y’a eu un seul site à prévalence supérieure à 10% sur les 34 sites étudiés. Par contre, dans la zone de Sikasso Est, 7 sites sur les 25 étudiés ont montré des prévalences supérieures à 10%.  Ces enquêtes ont aussi permis de confirmer le constat déjà fait sur la régression de la seule espèce de savane historiquement présente dans la région, qui est G.morsitans submorsitans (Djitteye,1997).

Tableau 4: Résultats de l’enquête longitudinale (étude3) analysés sur 28 jours

            L’utilisation des résultats des enquêtes transversales pour identifier les sites à forte prévalence à soumettre à l’évaluation de la chimiorésistance est également un point très important.  D’un côté, il est économiquement plus pertinent de s’intéresser à la chimiorésistance là où la trypanosomose  représente un problème, et d’un autre côté, il est techniquement impossible de réaliser les enquêtes longitudinales d’évaluation sur un grand nombre de sites à la fois.

            La méthode de Eisler, basée sur le suivi parasitologique d’animaux traités, constitue l’approche de base pour l’évaluation de la résistance à l’isometamidium sur le terrain. Cette méthode exige  un suivi d’au moins 8 semaines avec des examens parasitologiques de contrôle  tous les 14 jours. Les contraintes de cette méthode résident dans le fait que les paysans doivent consacrer  beaucoup de temps aux séances de contrôle, et souvent dans la nécessité de maintenir et de faire fonctionner sur le terrain des équipes de  techniciens et du matériel de laboratoire pendant plusieurs semaines.

Tableau 5:  Résultats de l’enquête longitudinale (étude 3) analysés sur 56j

            Dans la présente étude, nous avons voulu raccourcir le temps de suivi en introduisant un test de 28 jours exigeant seulement deux examens parasitologiques de  contrôle aux 14ème et 28ème jours après traitement, au lieu de 4 dans le protocole de Eisler

            La réduction du temps de suivi, combiné à  la faible taille des échantillons(40-50 bovins par groupe)  pose le problème du traitement des données notamment par les tests statistiques couramment  utilisés, qui sont le CHI-2 (Rowland) et l’analyse des courbes de survie et du rapport des risques entre groupe traité et groupe témoin (Eisler et al.2000) 

            Une analyse préalable des différents tests statistiques(Grace, 2005) a montré la pertinence des tests   basés sur les intervalles de confiance. C’est ainsi que, dans la présente évaluation de la résistance à l’isometamidium, nous avons procédé au calcul de la Réduction du Risque Relatif (RRR) pour ensuite en déduire le taux de protection maximal conféré par le produit et le taux d’échecs correspondant.  

            En l’absence d’un seuil consensuel à partir duquel un taux d’échecs peut être interprété comme signe d’une résistance à l’isometamidium, il a été adopté le taux de 25% proposé par l’OMS dans l’évaluation de la résistance au paludisme 

Tableau 6 : Taux d’échecs des traitements au diminazène

            Ce test simplifié a pu être comparé au test de 56 jours dans certains sites et sur les mêmes sujets ; les résultats ont montré une bonne concordance entre le test simplifié et le  test de 56 jours notamment dans les sites à forte prévalence (Sikasso Est).  Par contre, dans la zone de Sikasso Ouest, Bougouni, Yanfolila , où le risque d’infection s’est révélé particulièrement faible, le test de 56 jours s’est montré nettement plus sensible.

            Dans certains sites à faible prévalence, le suivi de 28 jours n’a pas permis d’obtenir un nombre d’infections suffisant pour l’analyse statistique.

Il serait important, pour pallier cet inconvénient, de conduire toutes les enquêtes pendant la période de forte transmission située généralement entre septembre et janvier.      

            Les taux d’échecs  révélés par l’épreuve de 28 jours doivent être considérés comme des minima, car des rechutes tardives auraient pu  apparaître, si le suivi avait été plus long.

            En ce qui concerne le diminazène, les infections observées 14 jours après un traitement ont été considérés comme des rechutes et celles observées plus tard, comme des réinfections. Là également les   taux d’échecs  rapportés sont certainement sous-estimés en raison de l’impossibilité de prendre en compte les rechutes tardives.

            En considérant les bornes inférieures des intervalles de confiance (voir Tab. 6), on peut dire que tous les taux d’échecs observés sont en dessous du seuil de 25%.  Cependant, compte tenu de la brièveté du suivi et de la non prise en compte des rechutes tardives, le taux  d’échecs de 37,5% (13,8-61,2%), Tiogola doit  raisonnablement éveiller des suspicions de chimiorésistance au diminazène.

Conclusion

            Cette étude a montré qu’une approche  combinant une enquête transversale pour évaluer les prévalences avec une épreuve de suivi parasitologique de sujets traités aux trypanocides sur 28 jours permettait de générer des données de base sur la trypanosomose et de donner une indication sur les niveaux de résistance à l’isometamidium et au diminazène, à l’échelle d’une zone.

            Ce test de 28 jours peut aussi être déconnecté de l’enquête d’évaluation des  prévalences, si l’on veut vérifier l’existence de la chimiorésistance dans des sites particulièrement  suspects et issus d’une zone où la situation générale de la trypanosomose est déjà connue.   

            La simplicité de l’épreuve et son caractère plus économe en temps et en moyens en font un outil précieux pour la détection et la surveillance des foyers de résistance aux trypanocides et pour la recommandation de stratégies de lutte  appropriées.

Remerciements

             Cette étude a été financée par la Coopération allemande BMZ/GTZ dans le cadre du  Projet No.2001.7860.8-001.00 exécuté par ILRI.

Bibliographie

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